[新书连载]溶瘤病毒治疗脑胶质瘤研究现状及进展(上)｜刘福生《脑胶质瘤基础与临床研究》第10期

本文摘自人民卫生出版社出版的《脑胶质瘤基础与临床研究》，作者刘福生、金贵善；《神外前沿》发布此文，已获出版社书面授权及作者本人许可。上图来源于网络。

第四节  溶瘤病毒治疗脑胶质瘤研究现状及进展（上）

溶瘤病毒治疗肿瘤是一种非常有发展前景的生物学治疗手段. 但从已完成的临床试验中不难看出. 其安全性和疗效仍亟待提高和改善. 前期的治疗策略多是以改造病毒减低病毒毒性、 引入自杀基因¯前 药系统等展开. 虽然溶瘤病毒的安全性得到保障. 但疗效却十分有限. 患者的生存期并未得到明显延 长. 病毒感 效率差、 在组织中分布低下以及宿主抗病毒免疫防御反应等都成为导致病毒治疗效果不佳 的原因。

目前的应对策略主要围绕以下几点展开: 改良病毒输注和运送方法. 靶向肿瘤干细胞. 重新设 计和改造溶瘤病毒使其更富有活力. 提高溶瘤病毒靶向特异性等. 此外. 联合疗法. 如溶瘤病毒治疗结 合免疫疗法. 或联合放疗、 化疗等都有望改善宿主的抗肿瘤免疫反应. 巩固和增强综合疗效. 

1 进一步改造病毒. 提升病毒毒力和肿瘤特异性 

关于这一点. 目前的临床前研究还是着重于通过保留病毒毒力及复制能力. 提高肿瘤特异性来实 现. 如溶瘤性单纯疱疹病毒. 策略之一是保留具有毒力的γ134 5 片段并插入肿瘤特异性启动子控制其表 达. 使 HSV 溶瘤病毒在不减弱其复制能力基础上提高其在肿瘤细胞中特异表达能力. 从而提高杀伤肿 瘤细胞能力. Nestin. 是一种中间丝蛋白. 又称巢蛋白. 仅在胚胎发育早期的神经上皮中表达. 出生后 表达就停止. 可能在神经元的分化过程中起作用. 由于 Nestin 仅在中枢神经系统中特异表达于神经前体 细胞. 为神经干细胞的特征性标志物. Yoo (2012) 等在γ1 34 5 片段前插入 Nestin 启动子. 使γ1 34 5 编 码的病毒蛋白不能在成熟的神经上皮细胞中表达. 但在癌变的胶质瘤细胞和脑肿瘤干细胞中却可表达. 使其具备了特异靶向并杀伤中枢神经系统肿瘤细胞的能力. 有研究表明. 经此改造过的溶瘤病毒对 Nes¯ tin 高表达的脑胶质瘤肿瘤细胞具有较为明显的溶瘤作用. 而对原低表达的肿瘤细胞效果则不明显. 

2 改良病毒输注和运送方法
1) 增强对流输送
增强对流输送 (convection enhanced delivery. CED) 是一种治疗脑胶质瘤的新的局部给药方法. 是 指利用影像学技术. 在立体定位条件下将一根或多根微导管. 直接植入瘤内或瘤腔周围脑组织. 体外连 接输液泵持续正压微量灌注. 导管末端输注点与周围组织形成压力梯度. 促使对流产生. 由此克服组织 间液内的阻力. 使药物在病变部位均匀扩散和分布. 

传统给药方式由于血脑屏障的存在. 药物进入颅内抵达瘤内或瘤周的浓度较低. 疗效较差. 一些局 部给药方式如直接注射等虽然绕过了血脑屏障. 但由于药物的扩散依赖于药物在组织间液中的浓度梯 度. 渗透力有限. 仅在注射部位附近的组织中扩散. 且药物分布不均匀. CED 克服了以上缺陷. 不仅绕 过了血脑屏障. 而且其药物的分布依靠的是压力梯度. 持续的压力促使药物不断向周围组织弥散. 药物 的分布范围更广. 分子量越大的药物越不易被毛细血管吸收. 能够更好地在组织间隙分布. 增加局部药 物浓度. 作用时间更为长久. 最初. 溶瘤病毒是以瘤内或瘤腔内注入的方式应用于抗肿瘤治疗性实验或 临床试验. 为了改善疗效. 又尝试了静脉内注射病毒的方式. 但是为了达到疗效. 需不断增加病毒剂 量. 虽然多数研究中并未达到病毒的最大耐受剂量. 但随着病毒剂量的增加. 毒副作用风险逐步加大. 而 CED 给药方式较其他方式相比可有效降低药物的使用浓度. 减轻对机体的全身性毒性反应.

能够采用 CED 方式进行输送的理想药物应具备如下特征: 对肿瘤细胞具有特异性的毒性. 对正常 脑组织的毒性有限. 半衰期长. 不易透过血脑屏障从而对机体的全身性毒性反应弱等. CED 首先于 1994 年. 由 Bobo (1994) 等最先提出. 源于许多大分子药物难以逾越血脑屏障到达颅内. 早期的 CED 临床试验在复发的脑恶性胶质瘤患者中进行. Laske (1997) 等在1997年应用该技术将Tf¯CRM107 (运 铁蛋白与一种白喉毒素无毒突变体 CRM107 的共轭物) 灌注于患者瘤内. 近 60% 患者的肿瘤体积至少 减少 50% (MRI 观察). 虽有局部的不良反应发生. 但未出现全身性毒性反应. 此研究证实了 CED 有 效运送大分子物质的能力. 且可在局部区域构成高浓度环境. 发生全身性毒性反应风险较小. 此后. 基 于CED临床前研究成果的临床试验逐渐展开. 美国国立卫生研究院批准了多项药物的临床I/II和III期 试验. 包括Topotecan、 Carboplatin、 IL13¯PE38QQR和溶瘤性腺病毒细胞毒性脊髓灰质炎病毒 (PVS¯RI¯ PO) 等. 这些药物用传统方式如静脉内或腹腔内给药或瘤内注射等疗效不佳、 效果有限. 但采用 CED 方式给药时均呈现较好疗效. PVS¯ RIPO 是目前唯一应用于经 CED 方式给药. 进入临床试验的溶瘤病 毒. PVS¯ RIPO 能够选择性感 黏附分子 nectin¯ like molecule 5 高表达的细胞. 通过干扰细胞 RNA 转录 达到溶瘤目的. 恶性胶质瘤由于过表达该分子. 成为 PVS¯ RIPO 的理想靶标. 针对复发性胶质母细胞瘤 的I期临床试验结果令人鼓舞. 显示出较好的安全性和疗效. 此外. 条件复制型腺病毒Delta¯24¯RGD 借助于 CED 的给药方式. 在临床前研究中显示较之传统方式疗效更为显著. 但尚未开展临床试验.

2) 利用干细胞作为病毒载体
宿主的抗病毒免疫反应是病毒治疗面临的一大障碍. 利用一种 “特洛伊木马” (Trojan horse). 使 其能够携带溶瘤病毒入体内又不被宿主免疫细胞所识别. 成为研究焦点. 细胞载体纳入研究者视野. 神 经干细胞、 骨髓来源的间充质干细胞和胚胎干细胞是目前最常采用细胞载体. 体外用病毒感 细胞. 体 内注入后即可携带病毒到达肿瘤部位释放出病毒. 且不被免疫系统所识别. 利用具有肿瘤趋向性的细胞 作为分子或生物治疗的载体目前已成为肿瘤治疗中重要策略之一. 

神经干细胞对脑肿瘤组织具有趋向性. 利用该特性. 使其作为载体携带治疗性基因或其他颗粒如质 粒、 病毒等. 可应用于侵袭性生长的脑胶质瘤的治疗. 我们研究小组曾证实. 自杀基因 CD 工程化的神 经干细胞可有效杀伤肿瘤细胞并延长荷瘤鼠的生存期. 其他研究也显示. 携带细胞因子白介素¯12 (IL¯12) 或肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体 (tumor necrosis factor related apoptosis¯inducing ligand. TRAIL) 的基因工程化神经干细胞可明显抑制肿瘤的生长. 但由于人类神经干细胞难以获得. 故大多数 实验转而应用人类间充质干细胞 (human mesenchymal stem cells. hMSC). 

hMSC 较易从患者身上获得. Nakamizo (2005) 等从健康自愿者的骨髓中分离提取出 hMSCs. 将其 应用于人胶质瘤颅内荷瘤鼠的治疗. 研究中发现. 无论是将 hMSCs 从颅内肿瘤的同侧或对侧的颈动脉 内注入. hMSCs 都会向颅内肿瘤区域聚集. 即使将 hMSCs 直接接种到颅内肿瘤对侧的大脑半球. 该趋 化作用依然存在. 进一步的研究表明. 该趋化作用与胶质瘤组织中的血小板源性生长因子 (platelet¯de¯ rived growth factor. PDGF)、 表皮生长因子 (epidermal growth factor. EGF) 以及基质细胞衍生因子¯1α (stromal cell¯derived factor¯1α. SDF¯1α) 等密切相关. 而与碱性成纤维细胞生长因子 (basic fibroblast growth factor. bFGF) 或血管内皮生长因子 (vascular endothelial growth factor. VEGF) 无关. 利用 hMSC 向胶质瘤的趋向性. 将其应用于腺病毒的运载有望提高腺病毒在颅内肿瘤组织中的分布. Sonabend (2008) 等用条件复制型溶瘤性腺病毒感 hMSCs. 体外实验中观察到携带腺病毒的 hMSCs 在向胶质瘤 细胞迁移后可释放腺病毒. 释放出的腺病毒继而感 胶质瘤细胞并在其中进行复制. 最后溶解肿瘤细 胞. 体内实验也表明. 将携带腺病毒的 hMSC 接种于颅内肿瘤的远端. 借助于 hMSCs 对胶质瘤肿瘤细胞 或组织的趋向性. 腺病毒在胶质瘤中的分布明显提高. 与对照组相比病毒拷贝数提高 46 倍之多. 胚胎干细胞是另一种可考虑用做病毒载体的干细胞. 胚胎干细胞作为基因载体应用于肿瘤治疗的研 究目前已有诸多报道. 并显示出较好的疗效. 是否能运用于作为病毒载体还有待进一步考证.

3 改善肿瘤微环境
肿瘤实体内不仅仅是肿瘤细胞. 还包括成纤维细胞、 内皮细胞等正常细胞. 这些细胞与细胞外基质共同构成并支撑了肿瘤生长的微环境. 另外. 肿瘤组织内的一些炎症细胞如肿瘤相关巨噬细胞等也具有 促进肿瘤生长的作用. 上述正常细胞在肿瘤组织内构成了一道屏障阻碍病毒的感 . 具有抵抗溶瘤病毒 的抗肿瘤作用. 纤维细胞外基质 (fibrous extracellular matris. ECM) 是一道病毒扩散的物理屏障. 有研 究表明细胞外基质蛋白沉积可抑制黏液瘤病毒在肿瘤、 腺病毒在乳腺转移癌中的扩散. 不仅肿瘤组织内 的正常细胞可构成对溶瘤病毒的防御. 由于肿瘤异质性. 一些肿瘤细胞亚群模拟正常细胞表型可完全或 部分抵抗溶瘤病毒的感 . 

Yoo (2012) 等通过在溶瘤病毒基因组中引入抗血管生成基因. 从而改善肿瘤微环境来实现溶瘤病 毒抗肿瘤效能的增强. Vstat120 是脑血管生成抑制因子 1 的细胞外片段. 具有抗血管生成作用. 有研究 显示其在恶性胶质瘤、 肺癌及胃癌中的表达下降. 实验表明 Vatat120 体外可抑制内皮细胞的增殖. 体内 抑制血管的生成. 在溶瘤病毒 HSV¯1 中插入 Vstat120 片段可增强其抗肿瘤效应. 其机理可能在于: 溶 瘤病毒 HSV¯ 1 在应用于肿瘤治疗时. 可下调肿瘤细胞外基质中 TSP¯ 1 蛋白的表达. 并使 Integrin¯ activa¯ ting CCN1 蛋白表达增加. 导致经溶瘤病毒治疗后的残余肿瘤组织中血管生成增加. 在溶瘤病毒中引入 Vatat120. 有可能通过降低由溶瘤病毒导致的血管通透性的增加. 延长溶瘤病毒在肿瘤组织中的播散和 抗肿瘤功效. Yoo (2012) 等通过在溶瘤病毒 HSV¯ 1 中的 γ134 5 片段前插入 Nestin 启动子. 并插入外 源基因 Vatat120 片段. 实现了对 Nestin 高表达胶质瘤细胞体内外抗肿瘤效应的增强. 

此外. 在病毒基因组表达血小板因子 4 (platelet factor 4. PF4). 一种抗血管生成因子. 可增强 G47Δ 杀伤内皮细胞能力. 表达显性位点失活突变的 FGF 受体的 G47Δ 可阻断 FGF 信号通路活性. 使病毒对内皮 细胞和胶质瘤细胞的杀伤能力明显提高并可抑制 ERK 磷酸化. 上述两种重组病毒. 体内均可抑制 U87 胶 质瘤肿瘤生长和瘤内血管生成. 血管抑素 (angiostatin)、 内皮抑素 (endostatin) 等武装的溶瘤性 HSV 或 腺病毒都有抑制肿瘤内内皮细胞及血管生成作用. 在破坏肿瘤微环境、 增强病毒扩散中发挥作用. 

肿瘤细胞间的细胞外基质 (extracellular matrix. ECM) 构成了病毒在肿瘤内扩散的物理屏障. 硫酸 软骨素酶 (chondroitinase ABC. Chase¯ ABC) 可破坏这一屏障. 利用表达 Chase¯ ABC 的 oHSV 治疗胶质 瘤. 病毒在肿瘤中的扩散增强. 抗肿瘤效果明显提高. 

主要作者简介：刘福生，教授，主任医师，研究员，博士研究生导师。首都医科大学附属北京天坛医院神经外科、北京市神经外科研究所脑肿瘤研究中心，北京市卫生技术高层次人才——神经外科学科带头人。

往期连载：

▼注册会员点击“阅读原文”；网址vipyiyi.com